Primers

Teniendo en cuenta que las variaciones que se han encontrado en el contig están sin estudiar o sin un estudio muy profundo, el equipo de investigación está interesado en ahondar aún más en su conocimiento para lo cual es necesario que se realicen clones de las secuencias que contienen dichas mutaciones de manera que es necesario diseñar los primers adecuados para la PCR. Estos primers flanquearán la secuencia de nucleótidos del gen SRY en reverse, pues es el único que presenta variaciones respecto al consenso, desde la base 121 hasta la 720 conteniendo en dicho fragmento las cuatro variaciones detectadas:

Figura 5.20  - Secuencia que se va a amplificar mediante PCR.

 

La herramienta que se utilizará para lograr este objetivo es Biotools que permite crear unos primers adecuados para la clonación. Aun así, aun utilizando la herramienta indicada, se deben tener unos parámetros en mente y que se deben revisar manualmente pues los primers deben tener como mínimo 18 nucleótidos, una proporción de 50% o superior de GC y una Tm (mealting temperature) superior a 50ºC. 

 

Los resultados que la herramienta Biotools encuentra son tres, ahora bien, de ellos solo uno no presenta ningún problema en base a las características indicadas anteriormente:

  • Left primer : GTTACCCGATTGTCCTACAGCT                                   Longitud= 22pb, Tm= 59,8ºC, %GC= 50
  • Right primer: CAATTTTGTCGCACTCTCCTTGT                                 Longitud= 23pb, Tm= 60ºC, %GC= 43,5
 
Figura 5.21- Primers obtenidos mediante la herramienta Biotools
 
Teniendo en cuenta las características básicas que se deben revisar manualmente al utilizar estas herramientas, se puede decir que la única pega que este par de primers presenta es que el Right Primer presenta un %GC inferior al 50% aunque está muy cercano al mismo.